液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀在雷尼替丁NDMA雜質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用實(shí)例
作者：上海熙華
王吉超、黃浩集
NDMA（N-二甲基亞硝胺），本是一個(gè)普普通通的化合物，卻因?yàn)?018年的纈沙坦事件紅遍大江南北，直至沖出亞洲走向世界。就在人們慢慢熟悉它、了解它，并覺得可以檢測(cè)它、控制它的時(shí)候，諾華又爆出其雷尼替丁中NDMA超標(biāo)，繼而又在傳統(tǒng)老藥-二甲雙胍中發(fā)現(xiàn)了它的存在。真是一波未平，一波又起……
值得注意的是，有報(bào)道稱雷尼替丁在使用HS-GC-MS/MS方法檢測(cè)的時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。有研究表明，該結(jié)果是因?yàn)椴糠掷啄崽娑悠吩贕C進(jìn)樣口的高溫環(huán)境下降解產(chǎn)生NDMA導(dǎo)致（圖1）。也許是冥冥之中早有定數(shù)，雷尼替丁作為一個(gè)普通的組胺H2受體阻斷劑，早在2012年【1】和2014年【2】就被當(dāng)作模型化合物用于研究三級(jí)胺的亞硝酸化反應(yīng)（圖2）。上述文獻(xiàn)顯示，雷尼替丁在氧化劑的作用下（NH2Cl，注意不是氯化銨，該化合物是一種消毒劑）作用下，能夠通過一系列復(fù)雜的分子內(nèi)反應(yīng)生成NDMA。
綜上，為了應(yīng)對(duì)假陽性結(jié)果可能導(dǎo)致的冤假錯(cuò)案，F(xiàn)DA隨即開發(fā)了一個(gè)LC-HRMS方法用于該產(chǎn)品NDMA雜質(zhì)的檢測(cè)（見附件，下載方式見下方“參考文獻(xiàn)”區(qū)域）。回過頭來看這個(gè)方法，有很多精妙之處：
首先，使用液相系統(tǒng)進(jìn)行分離就避免了氣相導(dǎo)致的API進(jìn)樣口熱分解問題；其次，該方法使用了一根ACE C18-AR柱（C18鏈有芳香基團(tuán)修飾），解決了NDMA這類大極性物質(zhì)的保留問題。最后，因?yàn)槭褂昧烁叻直尜|(zhì)譜，使得該方法具有非常優(yōu)異的專屬性，盡可能地避免了低分子量區(qū)的背景干擾，提高了方法的靈敏度。然而，對(duì)于大部分醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)來說，用一套高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)來做常規(guī)的定量分析與檢測(cè)工作，無疑是奢侈也是不現(xiàn)實(shí)的。
說到定量，毫無疑問，還是應(yīng)該請(qǐng)我們分析定量界的王者-三重四極桿質(zhì)譜上場(chǎng)。雖然屬于低分辯質(zhì)譜，但由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)（圖3），通過Q1篩選母離子，Q3篩選碎片離子來濾過干擾，大大降低了噪音信號(hào)，提高了分析靈敏度（圖4）。
為了考察三重四極桿質(zhì)譜對(duì)NDMA的檢測(cè)能力，我們從幾臺(tái)API 6500plus液質(zhì)系統(tǒng)（市面上靈敏度和穩(wěn)定性最突出的三重四級(jí)桿質(zhì)譜）中隨機(jī)選擇了一臺(tái)并開展了試驗(yàn)(圖5)。通過條件摸索，可知NDMA質(zhì)子加合物在常規(guī)CID（碰撞誘導(dǎo)解離）條件下，主要碎裂為m/z 43和m/z 58兩種碎片離子，推測(cè)其可能通過丟失甲醇分子以及羥基自由基【3】得到上述碎片（圖6）。鑒于該原理，我們使用m/z 43為定量離子，m/z 58作為定性離子。如圖7所示，使用FDA官方公布的液相條件，１ng/mL下NDMA對(duì)照品的信噪比為20.3，2ng/mL時(shí)為61.7，六針峰面積的RSD為2.5％。在有雷尼替丁及其制劑加標(biāo)的情況下，回收率在90%以上，結(jié)果令人滿意。但另一方面，我們發(fā)現(xiàn)該方法的基線噪音異常地高。這也比較容易理解，因?yàn)镹DMA質(zhì)子化后，質(zhì)荷比只有75，非常容易受到空氣、溶劑以及緩沖鹽體系中小分子雜質(zhì)的干擾，導(dǎo)致噪音較大。
如上所述，三重四極桿質(zhì)譜對(duì)NDMA的檢測(cè)能力令人滿意，我們相信類似的方法對(duì)于NDEA的檢測(cè)效果會(huì)更佳。因?yàn)镹DEA的分子量為102，受低分子量區(qū)雜質(zhì)的干擾更小，理論上應(yīng)該有更好的靈敏度。如圖9所示，在0.1ng/mL濃度下，NDEA的信噪比達(dá)到55，證實(shí)了上述推測(cè)。
綜上，雖然HS-GC-MS/MS和LC-HRMS在亞硝胺類雜質(zhì)檢測(cè)方面分別具有適用性廣和專屬性高的優(yōu)勢(shì)，但常見的三重四極桿質(zhì)譜同樣不落下風(fēng)，且由于其保有量較高，定量效果好，更適合在藥廠及檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)中推廣。
最后輕松一下，附上食品中常見亞硝胺類雜質(zhì)的含量情況，愛吃臘制食品的朋友們可以算算今天攝入了多少NDMA。
1. Julien Le Roux, Hervé Gallard, Jean-Philippe Croué, Sébastien Papot, and Marie Deborde. NDMA formation by chloramination of ranitidine: kinetics and mechanism. Environ. Sci. Technol. 2012, 46 (20), 11095?11103.
2. Yong Dong Liu, Meric Selbes, Chengchu Zeng, Rugang Zhong, and Tanju Karanfil. Formation Mechanism of NDMA from Ranitidine, Trimethylamine, and Other Tertiary Amines during Chloramination: A Computational Study. Environ. Sci. Technol. 2014, 48 (20), 8653?8663.
3. Yuan Yuan Zhao, Xin Liu, Jessica M. Boyd, Feng Qin, Jianjun Li, and Xing-Fang Li. Identification of N-Nitrosamines in Treated Drinking Water Using Nanoelectrospray Ionization High-Field AsymmetricWaveform Ion Mobility Spectrometry with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science. 2009, 47, 92-96.
