液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀在雷尼替丁NDMA雜質檢測中的應用實例
作者：上海熙華
王吉超、黃浩集
NDMA（N-二甲基亞硝胺），本是一個普普通通的化合物，卻因為2018年的纈沙坦事件紅遍大江南北，直至沖出亞洲走向世界。就在人們慢慢熟悉它、了解它，并覺得可以檢測它、控制它的時候，諾華又爆出其雷尼替丁中NDMA超標，繼而又在傳統老藥-二甲雙胍中發現了它的存在。真是一波未平，一波又起……
值得注意的是，有報道稱雷尼替丁在使用HS-GC-MS/MS方法檢測的時候，會出現假陽性結果。有研究表明，該結果是因為部分雷尼替丁樣品在GC進樣口的高溫環境下降解產生NDMA導致（圖1）。也許是冥冥之中早有定數，雷尼替丁作為一個普通的組胺H2受體阻斷劑，早在2012年【1】和2014年【2】就被當作模型化合物用于研究三級胺的亞硝酸化反應（圖2）。上述文獻顯示，雷尼替丁在氧化劑的作用下（NH2Cl，注意不是氯化銨，該化合物是一種消毒劑）作用下，能夠通過一系列復雜的分子內反應生成NDMA。
綜上，為了應對假陽性結果可能導致的冤假錯案，FDA隨即開發了一個LC-HRMS方法用于該產品NDMA雜質的檢測（見附件，下載方式見下方“參考文獻”區域）。回過頭來看這個方法，有很多精妙之處：
首先，使用液相系統進行分離就避免了氣相導致的API進樣口熱分解問題；其次，該方法使用了一根ACE C18-AR柱（C18鏈有芳香基團修飾），解決了NDMA這類大極性物質的保留問題。最后，因為使用了高分辨質譜，使得該方法具有非常優異的專屬性，盡可能地避免了低分子量區的背景干擾，提高了方法的靈敏度。然而，對于大部分醫藥生產企業來說，用一套高分辨液質聯用系統來做常規的定量分析與檢測工作，無疑是奢侈也是不現實的。
說到定量，毫無疑問，還是應該請我們分析定量界的王者-三重四極桿質譜上場。雖然屬于低分辯質譜，但由于其獨特的結構設計（圖3），通過Q1篩選母離子，Q3篩選碎片離子來濾過干擾，大大降低了噪音信號，提高了分析靈敏度（圖4）。
為了考察三重四極桿質譜對NDMA的檢測能力，我們從幾臺API 6500plus液質系統（市面上靈敏度和穩定性最突出的三重四級桿質譜）中隨機選擇了一臺并開展了試驗(圖5)。通過條件摸索，可知NDMA質子加合物在常規CID（碰撞誘導解離）條件下，主要碎裂為m/z 43和m/z 58兩種碎片離子，推測其可能通過丟失甲醇分子以及羥基自由基【3】得到上述碎片（圖6）。鑒于該原理，我們使用m/z 43為定量離子，m/z 58作為定性離子。如圖7所示，使用FDA官方公布的液相條件，１ng/mL下NDMA對照品的信噪比為20.3，2ng/mL時為61.7，六針峰面積的RSD為2.5％。在有雷尼替丁及其制劑加標的情況下，回收率在90%以上，結果令人滿意。但另一方面，我們發現該方法的基線噪音異常地高。這也比較容易理解，因為NDMA質子化后，質荷比只有75，非常容易受到空氣、溶劑以及緩沖鹽體系中小分子雜質的干擾，導致噪音較大。
如上所述，三重四極桿質譜對NDMA的檢測能力令人滿意，我們相信類似的方法對于NDEA的檢測效果會更佳。因為NDEA的分子量為102，受低分子量區雜質的干擾更小，理論上應該有更好的靈敏度。如圖9所示，在0.1ng/mL濃度下，NDEA的信噪比達到55，證實了上述推測。
綜上，雖然HS-GC-MS/MS和LC-HRMS在亞硝胺類雜質檢測方面分別具有適用性廣和專屬性高的優勢，但常見的三重四極桿質譜同樣不落下風，且由于其保有量較高，定量效果好，更適合在藥廠及檢驗檢測機構中推廣。
最后輕松一下，附上食品中常見亞硝胺類雜質的含量情況，愛吃臘制食品的朋友們可以算算今天攝入了多少NDMA。
1. Julien Le Roux, Hervé Gallard, Jean-Philippe Croué, Sébastien Papot, and Marie Deborde. NDMA formation by chloramination of ranitidine: kinetics and mechanism. Environ. Sci. Technol. 2012, 46 (20), 11095?11103.
2. Yong Dong Liu, Meric Selbes, Chengchu Zeng, Rugang Zhong, and Tanju Karanfil. Formation Mechanism of NDMA from Ranitidine, Trimethylamine, and Other Tertiary Amines during Chloramination: A Computational Study. Environ. Sci. Technol. 2014, 48 (20), 8653?8663.
3. Yuan Yuan Zhao, Xin Liu, Jessica M. Boyd, Feng Qin, Jianjun Li, and Xing-Fang Li. Identification of N-Nitrosamines in Treated Drinking Water Using Nanoelectrospray Ionization High-Field AsymmetricWaveform Ion Mobility Spectrometry with Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science. 2009, 47, 92-96.
