靈敏的檢測 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南

利用反相高效液相色譜法分離多肽時，通常通過在214-215 nm波長附近的紫外吸收檢測。
肽鍵在這一波長范圍內(nèi)吸收較好，為各類型多肽提供最靈敏的檢測。

采用短波紫外波段檢測的一個問題是流動相的吸收。
在波長215 nm處，乙腈不吸收紫外光，但TFA會略有吸收。
在梯度洗脫期間，增加有機(jī)溶劑的濃度會使溶液的介電常數(shù)發(fā)生改變，這將引起TFA在短波紫外波段吸收光譜的變化。
這一吸光度變化會導(dǎo)致基線上飄，如圖21所示。在需要靈敏檢測時尤其明顯。
在示例中，多肽圖譜經(jīng)常顯示出基線飄高（圖22）。避免基線漂移的常見做法是降低有機(jī)溶劑中TFA的濃度（相對于水溶性溶劑）。
如果在水溶性溶劑中加入0.1%的TFA，則在有機(jī)溶劑中加入0.08-0.09%的TFA。這將使多肽圖譜中的基線趨平。

 
圖21. 梯度洗脫期間，增加乙腈的濃度會改變流動相的介電常數(shù)，從而由于TFA吸收光譜的變化導(dǎo)致基線飄高。

圖22. 隨著有機(jī)溶劑濃度的增加，TFA吸收率變化可能引起多肽圖譜中基線的漂移。